Prodotti
Kit di rilevamento Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per 2019-nCoV
Utilizzo previsto
Questo kit è utilizzato per il rilevamento qualitativo del nuovo coronavirus (2019-nCoV) mediante tamponi faringei, tamponi nasofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare ed espettorato. Il risultato del rilevamento di questo prodotto è solo per riferimento clinico e non deve essere utilizzato come unica prova per la diagnosi clinica e il trattamento. Si raccomanda un'analisi completa della condizione in combinazione con le manifestazioni cliniche del paziente e altri esami di laboratorio.
Principio di ispezione
Il kit si basa sulla tecnologia RT-PCR one-step. Infatti, i geni ORF1ab e N del nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV) sono stati selezionati come regioni target di amplificazione. Primer specifici e sonde fluorescenti (le sonde del gene N sono marcate con FAM e le sonde ORF1ab sono marcate con HEX) sono progettati per rilevare l'RNA del nuovo coronavirus 2019 nei campioni. Il kit include anche un sistema di rilevamento del controllo interno endogeno (sonda del gene di controllo interno marcata con CY5) per monitorare il processo di raccolta del campione, l'RNA e l'amplificazione PCR, riducendo così i risultati falsi negativi.
Componenti principali
| Componenti | Volume(48T/Kit） |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 96µl |
| Miscela di sonde TaqMan di primer nCOV (gene ORF1ab, gene N, gene RNAseP) | 864µl |
| Controllo negativo | 1500µl |
| Controllo positivo nCOV（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Reagenti propri: reagenti per l'estrazione o la purificazione dell'RNA. Controllo negativo/positivo: il controllo positivo è costituito da RNA contenente il frammento target, mentre il controllo negativo è costituito da acqua priva di acidi nucleici. Durante l'uso, questi reagenti devono partecipare all'estrazione e devono essere considerati infetti. Devono essere maneggiati e smaltiti in conformità alle normative vigenti.
Il gene di riferimento interno è il gene umano RnaseP.
Condizioni di conservazione e data di scadenza
-20±5℃, evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti per più di 5 volte, valido per 6 mesi.
Strumento applicabile
Con FAM / HEX / CY5 e altri strumenti PCR fluorescenti multicanale.
Requisiti del campione
1. Tipi di campione applicabili: tamponi faringei, tamponi nasofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, espettorato.
2. Raccolta del campione (tecnica asettica)
Tampone faringeo: pulire le tonsille e la parete faringea posteriore con due tamponi contemporaneamente, quindi immergere la testa del tampone in una provetta contenente la soluzione di campionamento
Espettorato: dopo che il paziente ha tossito profondamente, raccogliere l'espettorato in una provetta con tappo a vite contenente la soluzione di campionamento; liquido di lavaggio broncoalveolare: campionamento da parte di personale medico. 3. Conservazione e trasporto dei campioni
I campioni per l'isolamento del virus e il test dell'RNA devono essere analizzati il prima possibile. I campioni rilevabili entro 24 ore possono essere conservati a 4°C; quelli non rilevabili entro 24 ore possono essere conservati a 4°C.
ore devono essere conservate a -70℃ o inferiore (se non ci sono condizioni di conservazione a -70℃, dovrebbero essere
Conservare temporaneamente in frigorifero a -20 °C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti durante il trasporto. Inviare i campioni al laboratorio il prima possibile dopo il prelievo. Se i campioni devono essere trasportati per lunghe distanze, si raccomanda la conservazione in ghiaccio secco.
Metodi di prova
1 Elaborazione del campione ed estrazione dell'RNA (area di elaborazione del campione)
Si consiglia di prelevare 200 μl di campione liquido per l'estrazione dell'RNA. Per le fasi di estrazione correlate, fare riferimento alle istruzioni dei kit di estrazione dell'RNA in commercio. Sia il negativo che il negativo
i controlli di questo kit sono stati coinvolti nell'estrazione.
2 Preparazione del reagente PCR (area di preparazione del reagente)
2.1 Rimuovere tutti i componenti dal kit, scongelarli e miscelarli a temperatura ambiente. Centrifugare a 8.000 giri/min per alcuni secondi prima dell'uso; calcolare la quantità necessaria di reagenti e preparare il sistema di reazione come mostrato nella tabella seguente:
| Componenti | Porzione N (sistema da 25µl) |
| Miscela di sonde TaqMan di primer nCOV | 18 µl × N |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numero di campioni testati + 1 (controllo negativo) + 1 (nCOVcontrollo positivo) | |
2.2 Dopo aver mescolato accuratamente i componenti, centrifugare per un breve periodo per far cadere tutto il liquido sulla parete della provetta sul fondo, quindi aliquotare il sistema di amplificazione da 20 µl nella provetta per PCR.
3 Campionamento (area di preparazione dei campioni)
Dopo l'estrazione, aggiungere 5 μl dei controlli negativo e positivo. L'RNA del campione da analizzare viene aggiunto alla provetta di reazione PCR.
Chiudere bene la provetta e centrifugare a 8.000 giri al minuto per alcuni secondi prima di trasferirla nell'area di rilevamento dell'amplificazione.
4 Amplificazione PCR (area di rilevamento amplificata)
4.1 Posizionare la provetta di reazione nella cella campione dello strumento e impostare i parametri come segue:
| palcoscenico | Ciclo numero | Temperatura(°C) | Tempo | collezionesito |
| Inversionetrascrizione | 1 | 42 | 10 minuti | - |
| Pre-denaturazionen | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 secondi | - |
| 60 | anni '30 | raccolta dati |
Selezione del canale di rilevamento dello strumento: selezionare i canali FAM, HEX e CY5 per il segnale di fluorescenza. Per il segnale di riferimento fluorescente NONE, non selezionare ROX.
5 Analisi dei risultati (per l'impostazione fare riferimento alle istruzioni sperimentali di ciascun strumento)
Dopo la reazione, salvare i risultati. Dopo l'analisi, regolare il valore iniziale, il valore finale e il valore di soglia della linea di base in base all'immagine (l'utente può regolare in base alla situazione reale, il valore iniziale può essere impostato su 3~15, il valore finale può essere impostato su 5~20, regolazione) nel grafico logaritmico. Alla soglia della finestra, la linea di soglia è in fase logaritmica e la curva di amplificazione del controllo negativo è una linea retta o al di sotto della linea di soglia).
6 Controllo qualità (un controllo procedurale è incluso nel test) Controllo negativo: nessuna curva di amplificazione evidente per i canali di rilevamento FAM, HEX, CY5
Controllo positivo COV: curva di amplificazione evidente dei canali di rilevamento FAM e HEX, valore Ct ≤ 32, ma nessuna curva di amplificazione del canale CY5;
I requisiti di cui sopra devono essere soddisfatti simultaneamente nello stesso esperimento; in caso contrario, l'esperimento non è valido e deve essere ripetuto.
7 Determinazione dei risultati.
7.1 Se non è presente alcuna curva di amplificazione o un valore Ct > 40 nei canali FAM e HEX del campione di prova, ed è presente una curva di amplificazione nel canale CY5, si può affermare che nel campione non è presente RNA del nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV);
.2 Se il campione di prova presenta curve di amplificazione evidenti nei canali FAM e HEX e il valore Ct è ≤40, si può ritenere che il campione sia positivo al nuovo coronavirus del 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se il campione di prova presenta una curva di amplificazione chiara solo in un canale di FAM o HEX, e il valore Ct è ≤40, e non è presente alcuna curva di amplificazione nell'altro canale, i risultati devono essere rianalizzati. Se i risultati dei rianalizzati sono coerenti, il campione può essere considerato positivo per il nuovo canale.
Coronavirus 2019 (2019-nCoV). Se il risultato del nuovo test è negativo, si può affermare che il campione è negativo per il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valore di giudizio positivo
Per determinare il valore di riferimento CT del kit viene utilizzato il metodo della curva ROC e il valore di riferimento del controllo interno è 40.
Interpretazione dei risultati dei test
1. Ogni esperimento deve essere testato per controlli negativi e positivi. I risultati dei test possono essere determinati solo se i controlli soddisfano i requisiti del controllo di qualità.
2. Quando i canali di rilevamento FAM e HEX sono positivi, il risultato del canale CY5 (canale di controllo interno) potrebbe essere negativo a causa della competizione del sistema.
3. Se il risultato del controllo interno è negativo, se anche i canali di rilevamento FAM e HEX della provetta sono negativi, significa che il sistema è disabilitato o che l'operazione è errata, il test non è valido. Pertanto, i campioni devono essere rianalizzati.
