Prodotti
Kit di rilevamento Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per 2019-nCoV
Utilizzo previsto
Questo kit viene utilizzato per il rilevamento qualitativo del nuovo coronavirus (2019-nCoV) utilizzando tamponi faringei, tamponi nasofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, espettorato. Il risultato del rilevamento di questo prodotto è solo per riferimento clinico e non deve essere utilizzato come unico prove per la diagnosi clinica e il trattamento. Si raccomanda un'analisi completa della condizione in combinazione con le manifestazioni cliniche del paziente e altri test di laboratorio.
Principio di ispezione
Il kit si basa sulla tecnologia RT-PCR one-step.Infatti, i geni ORF1ab e N del nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV) sono stati selezionati come regioni target dell’amplificazione.Primer specifici e sonde fluorescenti (le sonde del gene N sono etichettate con FAM e le sonde ORF1ab sono etichettate con HEX) sono progettati per rilevare l'RNA del coronavirus del nuovo tipo 2019 nei campioni.Il kit include anche un sistema di rilevamento del controllo interno endogeno (sonda del gene di controllo interno marcata con CY5) per monitorare il processo di raccolta del campione, amplificazione dell'RNA e della PCR, riducendo così i risultati falsi negativi.
Componenti principali
| Componenti | Volume（48T/Kit） |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 96μl |
| Miscela di sonde TaqMan di primer nCOV (gene ORF1ab, N, gene RnaseP) | 864 µl |
| Controllo negativo | 1500 µl |
| Controllo positivo nCOV（l ORF1ab N Gene） | 1500 µl |
Reagenti propri: reagenti per l'estrazione o la purificazione dell'RNA.Controllo negativo/positivo: il controllo positivo è l'RNA contenente il frammento target, mentre il controllo negativo è acqua priva di acido nucleico.Durante l'uso, dovrebbero partecipare all'estrazione e dovrebbero essere considerati infettivi.Dovrebbero essere maneggiati e smaltiti in conformità con le normative pertinenti.
Il gene di riferimento interno è il gene umano RnaseP.
Condizioni di conservazione e data di scadenza
-20±5℃, evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti più di 5 volte, valido per 6 mesi.
Strumento applicabile
Con FAM / HEX / CY5 e altri strumenti PCR fluorescenti multicanale.
Requisiti del campione
1. Tipi di campioni applicabili: tamponi faringei, tamponi nasofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, espettorato.
2. Raccolta dei campioni (tecnica asettica)
Tampone faringeo: pulire le tonsille e la parete faringea posteriore con due tamponi contemporaneamente, quindi immergere la testa del tampone in una provetta contenente la soluzione di campionamento
Espettorato: dopo che il paziente ha avuto una tosse profonda, raccogliere l'espettorato tossito in una provetta con tappo a vite contenente la soluzione di campionamento;Fluido di lavaggio broncoalveolare: campionamento da parte di professionisti medici.3.Conservazione e trasporto dei campioni
I campioni per l'isolamento del virus e il test dell'RNA devono essere analizzati il prima possibile.I campioni che possono essere rilevati entro 24 ore possono essere conservati a 4 ℃;quelli che non possono essere rilevati entro 24
le ore devono essere conservate a -70 ℃ o a una temperatura inferiore (se non esiste una condizione di conservazione di -70 ℃, devono essere
conservato temporaneamente in frigorifero a -20°C).I campioni devono evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti durante il trasporto.I campioni devono essere inviati al laboratorio il prima possibile dopo la raccolta.Se i campioni devono essere trasportati su lunghe distanze, si consiglia la conservazione in ghiaccio secco.
Metodi di prova
1 Elaborazione del campione ed estrazione dell'RNA (area di elaborazione del campione)
Si consiglia di prelevare 200μl di campione liquido per l'estrazione dell'RNA.Per le fasi di estrazione correlate, fare riferimento alle istruzioni dei kit di estrazione dell'RNA commerciali.Sia il negativo che il negativo
i controlli in questo kit sono stati coinvolti nell'estrazione.
2 Preparazione dei reagenti PCR (area di preparazione dei reagenti)
2.1 Rimuovere tutti i componenti dal kit, scongelarli e miscelarli a temperatura ambiente.Centrifugare a 8.000 giri per qualche secondo prima dell'uso;calcolare la quantità richiesta di reagenti e preparare il sistema di reazione come mostrato nella tabella seguente:
| Componenti | Porzione di N (sistema da 25 µl) |
| Miscela di sonde TaqMan di primer nCOV | 18 µl × N |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numero di campioni analizzati + 1 (controllo negativo) + 1 (nCOVcontrollo positivo) | |
2.2 Dopo aver miscelato accuratamente i componenti, centrifugare per un breve periodo per lasciare che tutto il liquido presente sulle pareti della provetta cada sul fondo della provetta, quindi aliquotare il sistema di amplificazione da 20 µl nella provetta PCR.
3 Campionamento (area preparazione campioni)
Aggiungere 5μl dei controlli negativo e positivo dopo l'estrazione.L'RNA del campione da testare viene aggiunto alla provetta di reazione PCR.
Tappare bene la provetta e centrifugare a 8.000 giri/min per alcuni secondi prima di trasferirla nell'area di rilevamento dell'amplificazione.
4 Amplificazione PCR (area di rilevamento amplificata)
4.1 Posizionare la provetta di reazione nella cella campione dello strumento e impostare i parametri come segue:
| palcoscenico | Ciclo numero | Temperatura(°C) | Tempo | collezioneluogo |
| Inversionetrascrizione | 1 | 42 | 10 minuti | - |
| Pre-denaturazionen | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 secondi | - |
| 60 | '30 | raccolta dati |
Selezione del canale di rilevamento dello strumento: selezionare il canale FAM、HEX、CY5 per il segnale di fluorescenza.Per la fluorescenza di riferimento NESSUNO, non scegliere ROX.
5 Analisi dei risultati (fare riferimento alle istruzioni sperimentali di ciascuno strumento per l'impostazione)
Dopo la reazione, salvare i risultati.Dopo l'analisi, regolare il valore iniziale, il valore finale e il valore di soglia della linea di base in base all'immagine (l'utente può regolare in base alla situazione reale, il valore iniziale può essere impostato su 3~15, il valore finale può essere impostato su 5~20, regolazione) nel grafico logaritmico Alla soglia della finestra, la linea di soglia è in fase logaritmica e la curva di amplificazione del controllo negativo è una linea retta o al di sotto della linea di soglia).
6 Controllo di qualità (nel test è incluso un controllo procedurale) Controllo negativo: nessuna curva di amplificazione evidente per i canali di rilevamento FAM, HEX, CY5
Controllo positivo COV: curva di amplificazione evidente dei canali di rilevamento FAM e HEX, valore Ct ≤ 32, ma nessuna curva di amplificazione del canale CY5;
I requisiti di cui sopra devono essere soddisfatti contemporaneamente nello stesso esperimento;in caso contrario, l'esperimento non è valido e deve essere ripetuto.
7 Determinazione dei risultati.
7.1 Se non è presente una curva di amplificazione o un valore Ct> 40 nei canali FAM e HEX del campione da testare e è presente una curva di amplificazione nel canale CY5, si può ritenere che non vi sia il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV) RNA nel campione;
.2 Se il campione del test presenta curve di amplificazione evidenti nei canali FAM e HEX e il valore Ct è ≤40, si può giudicare che il campione è positivo per il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se il campione in esame ha una curva di amplificazione chiara solo in un canale di FAM o HEX e il valore Ct è ≤40 e non è presente alcuna curva di amplificazione nell'altro canale, i risultati devono essere rianalizzati.Se i risultati del nuovo test sono coerenti, il campione può essere giudicato positivo per il nuovo
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Se il risultato del nuovo test è negativo, si può ritenere che il campione sia negativo per il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valore di giudizio positivo
Il metodo della curva ROC viene utilizzato per determinare il valore CT di riferimento del kit e il valore di riferimento del controllo interno è 40.
Interpretazione dei risultati dei test
1.Ogni esperimento deve essere testato per controlli negativi e positivi.I risultati dei test possono essere determinati solo quando i controlli soddisfano i requisiti del controllo di qualità
2.Quando i canali di rilevamento FAM e HEX sono positivi, il risultato del canale CY5 (canale di controllo interno) potrebbe essere negativo a causa della concorrenza del sistema.
3.Quando il risultato del controllo interno è negativo, se anche i canali di rilevamento FAM e HEX della provetta sono negativi, significa che il sistema è disabilitato o l'operazione è errata, il test non è valido.Pertanto, i campioni devono essere nuovamente analizzati.
