Prodotti
Kit di rilevamento Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per 2019-nCoV
Utilizzo previsto
Questo kit viene utilizzato per il rilevamento qualitativo del nuovo coronavirus (2019-nCoV) utilizzando tamponi faringei, tamponi rinofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, espettorato. Il risultato del rilevamento di questo prodotto è solo per riferimento clinico e non deve essere utilizzato come unico prove per la diagnosi clinica e il trattamento. Si raccomanda un'analisi completa della condizione in combinazione con le manifestazioni cliniche del paziente e altri test di laboratorio.
Principio di ispezione
Il kit si basa sulla tecnologia RT-PCR one-step.Infatti, i geni ORF1ab e N del nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV) sono stati selezionati come regioni bersaglio dell'amplificazione.Primer specifici e sonde fluorescenti (le sonde del gene N sono etichettate con FAM e le sonde ORF1ab sono etichettate con HEX) sono progettate per rilevare l'RNA del coronavirus di nuovo tipo 2019 nei campioni.Il kit include anche un sistema di rilevamento del controllo interno endogeno (sonda genica di controllo interno marcata con CY5) per monitorare il processo di raccolta del campione, RNA e amplificazione PCR, riducendo così i risultati falsi negativi.
Componenti principali
| Componenti | Volume（48 denti/kit） |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 96µl |
| Primer nCOV Miscela sonda TaqMan (ORF1ab, gene N, gene RnaseP) | 864µl |
| Controllo negativo | 1500µl |
| Controllo positivo nCOV（l gene ORF1ab N） | 1500µl |
Reagenti propri: reagenti di estrazione o purificazione dell'RNA.Controllo negativo/positivo: il controllo positivo è l'RNA contenente il frammento target, mentre il controllo negativo è l'acqua priva di acido nucleico.Durante l'uso, dovrebbero partecipare all'estrazione e dovrebbero essere considerati infettivi.Devono essere maneggiati e smaltiti in conformità con le normative pertinenti.
Il gene di riferimento interno è il gene RnaseP umano.
Condizioni di conservazione e data di scadenza
-20 ± 5 ℃, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti più di 5 volte, valido per 6 mesi.
Strumento applicabile
Con FAM / HEX / CY5 e altri strumenti PCR fluorescenti multicanale.
Requisiti del campione
1. Tipi di campioni applicabili: tamponi faringei, tamponi rinofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, espettorato.
2. Raccolta dei campioni (tecnica asettica)
Tampone faringeo: pulire le tonsille e la parete faringea posteriore con due tamponi contemporaneamente, quindi immergere la testa del tampone in una provetta contenente la soluzione di campionamento
Espettorato: dopo che il paziente ha una tosse profonda, raccogliere l'espettorato tossito in una provetta con tappo a vite contenente la soluzione di campionamento;fluido di lavaggio broncoalveolare: campionamento da parte di professionisti medici.3. Stoccaggio e trasporto dei campioni
I campioni per l'isolamento del virus e il test dell'RNA devono essere testati il prima possibile.I campioni che possono essere rilevati entro 24 ore possono essere conservati a 4℃;quelli che non possono essere rilevati entro 24
le ore devono essere conservate a -70℃ o al di sotto (se non ci sono condizioni di conservazione di -70℃, dovrebbero essere
temporaneamente conservato a -20℃frigorifero).I campioni devono evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti durante il trasporto.I campioni devono essere inviati al laboratorio il prima possibile dopo il prelievo.Se i campioni devono essere trasportati su lunghe distanze, si consiglia la conservazione in ghiaccio secco.
Metodi di prova
1 Elaborazione del campione ed estrazione dell'RNA (area di elaborazione del campione)
Si consiglia di prelevare 200μl di campione liquido per l'estrazione dell'RNA.Per le relative fasi di estrazione, fare riferimento alle istruzioni dei kit commerciali di estrazione dell'RNA.Sia il negativo che il negativo
i controlli in questo kit sono stati coinvolti nell'estrazione.
2 Preparazione del reagente PCR (area di preparazione del reagente)
2.1 Rimuovere tutti i componenti dal kit, scongelare e miscelare a temperatura ambiente.Centrifugare a 8.000 rpm per alcuni secondi prima dell'uso;calcolare la quantità richiesta di reagenti e il sistema di reazione viene preparato come mostrato nella tabella seguente:
| Componenti | N porzione (sistema da 25µl) |
| Primer nCOV miscela sonda TaqMan | 18 µl × N |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numero di campioni analizzati + 1 (controllo negativo) + 1 (nCOVcontrollo positivo) | |
2.2 Dopo aver miscelato accuratamente i componenti, centrifugare brevemente per far cadere tutto il liquido sulla parete della provetta sul fondo della provetta, quindi aliquotare il sistema di amplificazione da 20 µl nella provetta per PCR.
3 Campionamento (area di preparazione del campione)
Aggiungere 5μl dei controlli negativi e positivi dopo l'estrazione.L'RNA del campione da testare viene aggiunto alla provetta di reazione PCR.
Tappare bene la provetta e centrifugare a 8.000 rpm per alcuni secondi prima di trasferirla nell'area di rilevamento dell'amplificazione.
4 Amplificazione PCR (area di rilevamento amplificata)
4.1 Posizionare la provetta di reazione nella cella campione dello strumento e impostare i parametri come segue:
| palcoscenico | Ciclo numero | Temperatura(°C) | Tempo | collezioneluogo |
| Inversionetrascrizione | 1 | 42 | 10 minuti | - |
| Pre-denaturazionen | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 anni | - |
| 60 | anni '30 | raccolta dati |
Selezione del canale di rilevamento dello strumento: Selezionare il canale FAM、HEX、CY5 per il segnale di fluorescenza.Per riferimento NONE fluorescente, non scegliere ROX.
5 Analisi dei risultati (fare riferimento alle istruzioni sperimentali di ogni strumento per l'impostazione)
Dopo la reazione, salva i risultati.Dopo l'analisi, regolare il valore iniziale, il valore finale e il valore di soglia della linea di base in base all'immagine (l'utente può regolare in base alla situazione reale, il valore iniziale può essere impostato su 3~15, il valore finale può essere impostato su 5~20, regolazione) nel grafico logaritmico Alla soglia della finestra, la linea di soglia è nella fase logaritmica e la curva di amplificazione del controllo negativo è una linea retta o al di sotto della linea di soglia).
6 Controllo di qualità (nel test è incluso un controllo procedurale) Controllo negativo: nessuna curva di amplificazione evidente per i canali di rilevamento FAM, HEX, CY5n
Controllo COV positivo: evidente curva di amplificazione dei canali di rilevamento FAM e HEX, valore Ct≤32, ma nessuna curva di amplificazione del canale CY5;
I requisiti di cui sopra devono essere soddisfatti contemporaneamente nello stesso esperimento;in caso contrario, l'esperimento non è valido e deve essere ripetuto.
7 Determinazione dei risultati.
7.1 Se non c'è una curva di amplificazione o un valore Ct> 40 nei canali FAM e HEX del campione di prova, e c'è una curva di amplificazione nel canale CY5, si può ritenere che non ci sia il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV) RNA nel campione;
.2 Se il campione del test presenta evidenti curve di amplificazione nei canali FAM e HEX e il valore Ct è ≤40, si può ritenere che il campione sia positivo per il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se il campione di prova ha una curva di amplificazione chiara solo in un canale di FAM o HEX, e il valore Ct è ≤40, e non c'è curva di amplificazione nell'altro canale, i risultati devono essere testati nuovamente.Se i risultati della ripetizione del test sono coerenti, il campione può essere giudicato positivo per il nuovo
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Se il risultato del nuovo test è negativo, si può ritenere che il campione sia negativo per il nuovo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valore di giudizio positivo
Il metodo della curva ROC viene utilizzato per determinare il valore CT di riferimento del kit e il valore di riferimento del controllo interno è 40.
Interpretazione dei risultati del test
1.Ogni esperimento dovrebbe essere testato per controlli positivi e negativi.I risultati dei test possono essere determinati solo quando i controlli soddisfano i requisiti del controllo di qualità
2. Quando i canali di rilevamento FAM e HEX sono positivi, il risultato del canale CY5 (canale di controllo interno) potrebbe essere negativo a causa della concorrenza del sistema.
3. Quando il risultato del controllo interno è negativo, se anche i canali di rilevamento FAM e HEX della provetta sono negativi, significa che il sistema è disabilitato o il funzionamento è errato, t il test non è valido.Pertanto, i campioni devono essere nuovamente testati.
